Многофункциональный одноклеточный профилирование показывает общую и специализированную клеточную уязвимость при болезни Альцгеймера

mNeonGreen (mNG) является одним из самых ярких и устойчивых к фотодеградации мономерных зеленых флуоресцентных белков и широко используется для метки белков. В данной работе мы представляем sdAb(mNG), антитело единственного домена (sdAb) с высокой аффинностью, которое позволяет проводить биохимический захват, визуализацию и манипуляцию белками, мечеными mNG. Кристаллическая структура с разрешением 1,26 Å выявляет обширную поверхность взаимодействия между mNG и sdAb(mNG), что объясняет его высокую аффинность (KD = 0,39 нМ) и надежное распознавание мишеней в различных экспериментальных условиях. Это позволяет одному sdAb поддерживать приложения, которые обычно требуют нескольких специализированных инструментов. Мы демонстрируем полезность sdAb(mNG) в нескольких примерах приложений, включая высокоспецифическую иммунотерапию, прямую иммунофлуоресценцию и суперразрешающую визуализацию. Важно, что sdAb(mNG) сохраняет высокую эффективность распознавания мишеней даже в клеточных условиях. Когда он экспрессируется как интрабоди в живых млекопитающих клетках, sdAb(mNG) позволяет релокализацию белков, меченых mNG, в определенные компартменты или визуализацию транспорта синаптических пузырьков в первичных нейронах. В зебровых рыбках слияние sdAb(mNG) с деградационным доменом F-box индукцирует клеточно-автономное истощение эндогенного фактора транскрипции, меченого mNG, и приводит к явному морфологическому фенотипу. Эти результаты подтверждают, что sdAb(mNG) является универсальным и надежным аффинным реагентом, который превращает mNG из пассивного флуоресцентного репортера в многофункциональный инструмент для визуализации, протеомики и программируемой манипуляции эндогенными и инженерными белками.

Обнаружение мутаций митохондриальной ДНК (мтДНК) на уровне отдельных клеток имеет значительный потенциал для определения клональных связей в масштабе, в сочетании с информацией о состоянии клеток у человека. Предыдущие методы фокусировались на мутациях с высокой гетероплазмией, которые, хотя и содержат ценные данные, редки и могут подвергаться функциональному отбору, что ограничивает информацию о родстве и потенциально вводит искажения в отслеживании. Хотя более сложно обнаружить, промежуточные и низкие мутации с гетероплазмией мтДНК имеют ценность из-за своего высокого разнообразия, обилию и меньшей предрасположенности к отбору. Для улучшения обнаружения мутаций мтДНК и содействия точному отслеживанию родословной мы разработали подход, называемый «Регуляторный мультиомикс с глубоким профилированием митохондриальных мутаций» (ReDeeM), представляющий собой интегрированную экспериментальную и вычислительную структуру. Здесь мы конкретно рассматриваем две аналитические проблемы, которые являются центральными для анализа родословной на основе мтДНК: достоверность рабочих процессов вызова вариантов и надежность филогенетического вывода. Мы демонстрируем, что, воспользовавшись ошибками поправки на основе консенсуса, вызовы мутаций мтДНК ReDeeM достигают высокой достоверности, соотносясь с настоящими мутационными сигнатурами даже для мутаций, поддерживаемых одной молекулой на клетку. Мы также разработали улучшенный подход к фильтрации после консенсуса, названный «filter2», который систематически идентифицирует и фильтрует остаточные артефакты, обогащенные краями, хотя они затрагивают лишь меньшинство вызовов мутаций. Чтобы систематически проверить ReDeeM, мы недавно провели эксперимент с лентивирусным баркодированием в человеческих гемопоэтических стволовых клетках, уникально пометив каждую клетку перед ее расширением и дифференциацией, чтобы предоставить основную правду для оценки точности отслеживания родословной. Такая валидация демонстрирует, что оригинальный аналитический подход ReDeeM (filter1) надежно восстанавливает истинную клональную структуру с высокой разрешающей способностью и отзывчивостью. Включение промежуточных и низких вариантов гетероплазмии (<10% на клетку) значительно улучшает выводы о родословной, в то время как исключение мутаций, поддерживаемых одной молекулой на клетку, удаляет истинный клональный сигнал и ухудшает восстановление истинных клонов. Оба фильтра filter1 и filter2 точно восстанавливают истинные клоны и превосходят ранее использовавшиеся подходы на основе мтДНК в отношении точности и отзывчивости, при этом filter2 обеспечивает дополнительные улучшения в производительности. Наконец, хотя ReDeeM продвигает отслеживание родословной на основе мтДНК, восстанавливая истинные клоны с высокой разрешающей способностью, количественная оценка филогенетической неопределенности от митохондриального наследования остается нерешенной. Для решения этой проблемы мы недавно разработали и проверили MitoDrift как платформу следующего поколения, учитывающую дрейф для отслеживания родословной мтДНК, которая дополнительно укрепляет филогенетический вывод и предоставляет интерпретируемые оценки неопределенности.

Картирование на основе заданий стало многообещающей техникой в функциональной магнитно-резонансной томографии (фМРТ) для надежной характеристики и картирования уникальных паттернов активности отдельных людей. Эти эксперименты включают в себя получение обширных данных визуализации у одного участника, что в конечном итоге улучшает чувствительность и специфичность индивидуальной функциональной локализации. Несмотря на свои преимущества, исследования в основном сосредотачивались на понимании специфической активации коры, что препятствует целостному взгляду на функциональный ответ на уровне систем, и до настоящего времени лучшие подходы к статистическому анализу контролируемых заданий на основе плотно собираемых данных всего мозга еще не были полностью установлены. Поэтому в этом исследовании мы собрали данные многоканальной плотно собранной фМРТ аудиологической системы, которая имеет основные подкорковые компоненты, и оценили чувствительность активации, а также стабильность активации в подмножествах данных, используя стандартные подходы к тестированию выводов на уровне всего мозга и специфичных регионов. Подходы на уровне всего мозга включали стандартные схемы вывода на уровне вокселей и кластеров с различными статистическими порогами, а также непараметрический метод перестановочного вывода. Регионально-специфические подходы включали исследовательские методы топ % t-статистик и непараметрические методы перестановочного вывода. Мы обнаружили, что подход на уровне вокселей с коррекцией по уровню ложных открытий (FDR) (p<0.05) продемонстрировал наивысшую чувствительность среди регионов и субъектов, а также наиболее последовательное обнаружение ожидаемых слуховых регионов, даже при более низкой продолжительности сканирования. Кроме того, мы обнаружили, что подход с использованием т-статистики на уровне регионов может быть полезным исследовательским инструментом функциональной локализации и дополнительным методом к стандартным подходам к тестированию выводов.

ВВЕДЕНИЕ. Невротизм является установленным фактором риска болезни Альцгеймера (БА), однако молекулярные механизмы, связывающие эту черту личности с нейродегенерацией, до сих пор слабо изучены. МЕТОДЫ. Мы использовали данные секвенирования РНК на уровне отдельных ядер из лонгитюдных когортных исследований когнитивного старения (n = 655), чтобы изучить механизмы, опосредующие связь между невротизмом и БА. РЕЗУЛЬТАТЫ. Мы идентифицировали два гена, ассоциированных с невротизмом, оба из которых сниженны в возбуждающих нейронах: ADRA1B и LY6E-DT. Кроме того, мы обнаружили, что невротизм ассоциируется с обогащением специфической подс-popуляции возбуждающих нейронов: Exc.12. Дополнительный анализ показал, что Exc.12 частично опосредует отношение между невротизмом и БА, составляя 12,2% от общего эффекта. ДИСКУССИЯ. Дисрегуляция возбуждающих нейронов может представлять собой ключевое клеточное изменение, связывающее невротизм с БА.

Интрогрессия от несampled гоминидных линий стала все более важным элементом истории человеческой эволюции. Недавние исследования показывают, что глубоко отличающиеся линии гоминид могли внести предковую составляющую либо непосредственно в современного человека, либо косвенно через интрогрессию от денисовцев, в то время как выводы остаются сложными из-за нехватки эталонных геномов, слабого сигнала и неопределенности в реконструкции глубоких генеалогий. Мы показываем аналитически и с помощью симуляций, что интрогрессия, опосредованная денисовцами, производит предсказуемые изменения в локальной коалиционной глубине, которые можно приблизительно оценить с помощью масштабируемых обобщенных статистик, в частности парной последовательной дивергенции, что указывает на то, что значительная информация о глубоко различающемся предке сохраняется в вариациях последовательностей без явной реконструкции генеалогий. Используя этот инсайт, мы разрабатываем DEEP (Точная оценка глубокого предка с использованием эффективных прокси), нейросетевую структуру без ARG для выявления кандидатных регионов суперархайческого предка. DEEP сохраняет обнаружимую мощность при низких уровнях ложных позитивов в широком диапазоне демографических параметров, остается масштабируемым и восстанавливает сигналы из небольших выборок. Применяя DEEP к океанийцам, тибетцам и ханьцзам, мы определяем примерно 0,4–0,6 % геномных окон с доказательствами суперархайческого предка. Кандидатные регионы показывают как значительное наложение, так и заметную неоднородность между популяциями, с повторным обогащением вблизи локуса HLA во всех популяциях, что указывает на то, что иммунные регионы повторно сохраняют глубоко различающуюся предковую составляющую.

Дисрегуляция фибробластов способствует патологической фиброзе и аномальному восстановлению. Новые данные свидетельствуют о том, что фибробласты накапливаются в поражениях после повреждения центральной нервной системы, но неясно, каким образом они влияют на восстановительные реакции олигодендроцитов, особенно в условиях старения. В данной работе мы сообщаем, что фибробласты накапливаются в паренхиме белого вещества спинного мозга молодыми мышами в возрасте 6–10 недель после демиелинизации, вызванной лиозолецитином. Это было впервые зафиксировано с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии с использованием нескольких маркеров, относящихся к фибробластам, включая тромбоцитарный фактор роста-{бета}, коллаген тип 11, гладкомышечный актин, периостин и фибронектин; а также с использованием трансгенных мышей с отчетчиком TdTomato на основе тромбоцитарного фактора роста-{бета}. Одноядерная и пространственная транскриптомика поражений, вызванных лиозолецитином, установила наличие фибробластов в этих поражениях и выделила их из близкородственных перицитов. Анализ лиганды-рецепторы CellChat подчеркивает фибробласты в среде лиозолецитина как основной источник сигналов для микроглии/макрофагов и предшественников олигодендроцитов, с множеством взаимных взаимодействий. Проникновение фибробластов было стимулировано микроглией/макрофагами, как и ожидалось из их временного представления в поражениях, вызванных лиозолецитином, и из экспериментов в культуре тканей, где миграция фибробластов была усилена макрофагами. Особую значимость для спонтанных регенеративных событий при демиелинизации, вызванной лиозолецитином, имеет то, что области накопления фибробластов были свободны от предшественников олигодендроцитов. В культуре тканей предшественники олигодендроцитов не могли проникнуть в области фибробластов. Более того, накопление фибробластов после травмы, вызванной лиозолецитином, усиливается с увеличением возраста, что является известным фактором, препятствующим способности к ремиелинизации после травмы, и исключение предшественников олигодендроцитов из областей фибробластов у мышей в возрасте 48–52 недель превышает показатели у более молодых животных в возрасте 6–10 недель. Наконец, при анализе общедоступной базы данных одноядерной РНК при рассеянном склерозе мы обнаружили фибробласты на краях хронически активных и хронически неактивных поражений, а также в их центрах, но в меньшем количестве в перифокальных или нормальных белых веществах. Мы выявили несколько сетей коммуникации между фибробластами, микроглией/макрофагами и предшественниками олигодендроцитов в этих поражениях при рассеянном склерозе. Наши коллективные результаты демонстрируют роль фибробластов в невропатологии, ассоциированной с демиелинизацией, которая усугубляется старением, и подчеркивают важность регулирования фибробластов для содействия эффективному восстановлению центральной нервной системы.