Нанободи с высокой аффинностью к mNeonGreen: универсальные биохимические, клеточные и in vivo приложения.

Болезнь Альцгеймера (БА) определяется и стадийно классифицируется на основе стереотипного, прогрессирующего накопления амилоид-бета (A{beta}) бляшек и гиперфосфорилированных тау (pTau) нейрофибриллярных клубков в различных областях мозга. Эти области существенно различаются по своей архитектуре и функциям, но в значительной степени сохраняют клеточный состав, с некоторой региональной спецификацией. Поскольку патология накапливается, определенные нейроны теряются, а не нейронные клетки переходят в состояния, ассоциированные с болезнью, но остается неясным, являются ли типы клеток, пораженные в одной области, такими же в других областях. Здесь мы расширили Атлас клеток мозга при болезни Альцгеймера в Сиэтле (SEA-AD) на десять неокортекальных и аллокортекальных областей, охватывающих кортикальную дугу канонического стадирования БА, профилируя приблизительно семь миллионов ядер от 84 доноров с помощью секвенирования РНК с одиночными ядрами, ATAC-seq и Multiome наряду с количественной нейропатологией и секвенированием всего генома. Ядра были сопоставлены с расширенной референсной таксономией Инициативы BRAIN, содержащей 207 типов клеток, иерархическая псевдо-прогрессия обеспечила непрерывные, донорные уровни оценки патологии БА в каждой области и по всему мозгу, совместно моделируя A{beta} и pTau. Изменения в клетках были как высокоспецифичными, так и поразительно последовательными: лишь около 30% типов клеток изменились в относительной частоте, но те, кто изменился, изменились в согласованном направлении в различных областях. Конкретные подмножества ингибирующих интернейронов Sst, Lamp5, Vip, Sncg и Pvalb, а также миелинизирующих олигодендроцитов были потеряны скорее всего на самых ранних стадиях у донора с минимальной патологией, наряду с первоначальным появлением ассоциированных с БА микроглией; потеря типов возбуждающих нейронов L2/3 и некоторых глубоких слоев, резкий рост микроглии и появление реактивных астроцитов последовали у доноров на более поздних стадиях. Регионально специализированные популяции также оказались уязвимыми, включая ожидаемые аллокортекальные типы, а также, неожиданно, специализированные возбуждающие нейроны слоя 4 (L4 IT) первичной зрительной коры (V1C) и смешанные ингибирующие интернейроны Sst и Pvalb. Ключевые изменения воспроизводились в трех независимых когортах, охватывающих более 700 дополнительных доноров. Мы исследовали два взаимодополняющих уязвимых населения в механистических подробностях: регионально специализированные нейроны V1C L4 IT, которые были потеряны поздно, несмотря на то, что их широко считали устойчивыми, и пан-кортикальные интернейроны Sst, которые потерялись в первые стадии болезни. Применяя многогранный ИИ-рабочий процесс, который конструировал гипотезы, основанные на литературе из дифференциального экспрессии для нейронов L4 IT, были выделены гипервозбудимость, частично опосредованная высоким уровнем экспрессии NMDA-рецепторов, как сходный фенотип уязвимости. Уязвимые интернейроны Sst сходились на гипервозбудимости через частично различные пути и обогащались экспрессией генов, приоритизированных в GWAS для БА, связывая их уязвимость с генетической архитектурой БА. Эти данные, доступные на SEA-AD.org, предоставляют многофункциональный региональный каркас для сообщества, чтобы исследовать молекулярные и клеточные изменения прогрессирования БА.

Прямые повреждения от жары считались второстепенной причиной смертности деревьев и снижения продуктивности в лесах, вызванного изменениями климата, по сравнению с влиянием изменений климата на водные отношения деревьев. Однако накапливаются данные из умеренных и тропических лесов, что прямые повреждения от жары в фотосистеме II (ФС II), не зависящие от водных отношений, также являются реальным сценарием в условиях изменения климата. Мы проанализировали тепловую устойчивость ФС II у Ларикса сибирского, который представляет собой доминирующий вид бореальных деревьев в Сибири и северной Центральной Азии в холодной среде с отрицательными или близкими к нулю средними годовыми температурами, но тем не менее с теплыми летами. Мы использовали тепловизионную съемку, чтобы соотнести температурные пороги, найденные в лаборатории, с температурами крон в лесах на северных склонах гор, которые являются основным местом обитания Л. сибирского. Л. сибирский показал небольшое снижение максимального квантового выхода ФС II (Fv/Fm) при 35 °C и 40 °C после 4 часов, но сильные снижения при ≥45 °C и незначительное увеличение Fv/Fm в конце лета, что можно интерпретировать как акклимацию к теплу. Температуры крон в исследуемый год не достигли порогов для серьезного повреждения от жары ФС II. Однако Л. сибирский был более чувствителен к теплу, чем умеренные хвойные деревья. Это первое совместное исследование тепловой устойчивости и температур крон бореальных лесов указывает на возможность низкой тепловой устойчивости бореальных древесных видов, но такой вывод требует исследования большего числа видов деревьев.

Идиопатический легочный фиброз — это прогрессирующее и фатальное заболевание легких, характеризующееся необратимым рубцеванием ткани, структурными нарушениями и снижением функции дыхания. Хотя в настоящее время одобрены противофибротические терапии, которые могут замедлить прогрессирование заболевания, они не могут остановить или обратить рубцевание, что подчеркивает необходимость лучшего понимания механизмов болезни. Все больше доказательств указывает на то, что клеточный сенесценс является центральным биологическим процессом, связывающим старение, уязвимость эпителиальных клеток, митохондриальную дисфункцию и аномальное восстановление ткани при легочном фиброзе. Сенесцентные эпителиальные и мезенхимальные клетки остаются метаболически активными и выделяют широкий спектр секретируемых факторов, которые способствуют активации фибробластов, постоянству сократительных клеток и чрезмерной депозиции матрикса. Недавние достижения в использовании одноячеечных и трехмерных культурах дополнительно показывают накопление переходных состояний эпителиальных клеток, которые не завершают нормальную дифференциацию и вместо этого продолжают фиброзное ремоделирование. Эти выводы предполагают, что сенесценс представляет собой не просто следствие повреждения ткани, а самоподдерживающий механизм прогрессирования заболевания. Этот обзор объединяет современные механистические представления о том, как клеточный сенесценс координирует повреждение эпителия, дисфункцию иммунной системы иBiomechanical feedback для стимуляции легочного фиброза. Мы также обсуждаем новые терапевтические стратегии, направленные на сенесцентные клетки или их сигнальные пути, подчеркивая их потенциал дополнить существующие противофибротические лечения и обеспечить более эффективную модификацию заболевания.

Обнаружение мутаций митохондриальной ДНК (мтДНК) на уровне отдельных клеток имеет значительный потенциал для определения клональных связей в масштабе, в сочетании с информацией о состоянии клеток у человека. Предыдущие методы фокусировались на мутациях с высокой гетероплазмией, которые, хотя и содержат ценные данные, редки и могут подвергаться функциональному отбору, что ограничивает информацию о родстве и потенциально вводит искажения в отслеживании. Хотя более сложно обнаружить, промежуточные и низкие мутации с гетероплазмией мтДНК имеют ценность из-за своего высокого разнообразия, обилию и меньшей предрасположенности к отбору. Для улучшения обнаружения мутаций мтДНК и содействия точному отслеживанию родословной мы разработали подход, называемый «Регуляторный мультиомикс с глубоким профилированием митохондриальных мутаций» (ReDeeM), представляющий собой интегрированную экспериментальную и вычислительную структуру. Здесь мы конкретно рассматриваем две аналитические проблемы, которые являются центральными для анализа родословной на основе мтДНК: достоверность рабочих процессов вызова вариантов и надежность филогенетического вывода. Мы демонстрируем, что, воспользовавшись ошибками поправки на основе консенсуса, вызовы мутаций мтДНК ReDeeM достигают высокой достоверности, соотносясь с настоящими мутационными сигнатурами даже для мутаций, поддерживаемых одной молекулой на клетку. Мы также разработали улучшенный подход к фильтрации после консенсуса, названный «filter2», который систематически идентифицирует и фильтрует остаточные артефакты, обогащенные краями, хотя они затрагивают лишь меньшинство вызовов мутаций. Чтобы систематически проверить ReDeeM, мы недавно провели эксперимент с лентивирусным баркодированием в человеческих гемопоэтических стволовых клетках, уникально пометив каждую клетку перед ее расширением и дифференциацией, чтобы предоставить основную правду для оценки точности отслеживания родословной. Такая валидация демонстрирует, что оригинальный аналитический подход ReDeeM (filter1) надежно восстанавливает истинную клональную структуру с высокой разрешающей способностью и отзывчивостью. Включение промежуточных и низких вариантов гетероплазмии (<10% на клетку) значительно улучшает выводы о родословной, в то время как исключение мутаций, поддерживаемых одной молекулой на клетку, удаляет истинный клональный сигнал и ухудшает восстановление истинных клонов. Оба фильтра filter1 и filter2 точно восстанавливают истинные клоны и превосходят ранее использовавшиеся подходы на основе мтДНК в отношении точности и отзывчивости, при этом filter2 обеспечивает дополнительные улучшения в производительности. Наконец, хотя ReDeeM продвигает отслеживание родословной на основе мтДНК, восстанавливая истинные клоны с высокой разрешающей способностью, количественная оценка филогенетической неопределенности от митохондриального наследования остается нерешенной. Для решения этой проблемы мы недавно разработали и проверили MitoDrift как платформу следующего поколения, учитывающую дрейф для отслеживания родословной мтДНК, которая дополнительно укрепляет филогенетический вывод и предоставляет интерпретируемые оценки неопределенности.

Листки плазматической мембраны, созданные с помощью контролируемого механического разрушения, обеспечивают прямой доступ к цитозольной стороне плазматической мембраны при сохранении родной организации мембраноассоциированных белков и липидов. Здесь мы представляем протокол для генерации и валидации листков плазматической мембраны, полученных с использованием соникации, из культур клеток, первичных нейронов и изолированных синаптосом. Мы также описываем их применение для живой и фиксированной визуализации локализации мембранных белков, их организации, конформационной динамики и взаимодействий белков, а также количественных испытаний рекрутирования мембраноассоциированных синаптических пузырьков. Эта универсальная платформа сохраняет родную среду мембраны и одновременно позволяет проводить прямую визуализацию и количественный анализ мембраноассоциированных процессов с высоким пространственным разрешением. Протокол может быть легко адаптирован для изучения различных мембранных белков, зависимых от липидов механизмов и событий, связанных с прикреплением пузырьков, в широком круге клеточных систем.

Приобретенная резистентность к цисплатину ограничивает эффективность химиотерапии при прогрессирующем немалоклеточном раке легкого (НМРЛ). Выявление ключевых регуляторов резистентности имеет клиническое значение. Хотя TAK1 (киназа 1, активируемая трансформирующим ростовым фактором бета) была вовлечена в резистентность к лекарствам, ее роль в цисплатинорезистентной аденокарциноме легких остается неясной. Биоформатный анализ данных Gene Expression Omnibus (GEO) выявил TAK1 как ген, связанный с резистентностью. Экспрессия TAK1 была повышена в клинических образцах и клеточных линиях (A549R, PC9R), положительно коррелируя с увеличением белков, выводящих лекарства: P-гликопротеина (P-gp) и члена 2 подсемейства G AТФ-связывающих кассет (ABCG2). Ингибитор TAK1 (5Z)-7-оксоцеаенол (5Z7) взаимодействовал с цисплатином, подавляя пролиферацию и эпителиально-мезенхимальный переход, индуцируя апоптоз, вызывая арест на стадии G0/G1 и способствуя старению резистентных клеток. Генетическое ингибирование TAK1 показало аналогичные тенденции. Механистически 5Z7 ингибировал ось TAK1-IκB киназы (IKK), блокируя фосфорилирование ингибитора IκBα и транслокацию ядерного фактора каппа-B (NF-κB) p65 в ядро, в то время как он повышал уровень p53 и его дочерних эффекторов p21/p16 - эффекты, которые были обратимыми при активаторе NF-κB или ингибиторе p53. In vivo 5Z7 в сочетании с цисплатином подавлял рост резистентных опухолей без заметной токсичности для органов. Это исследование устанавливает TAK1 как ключевой узел в резистентности к цисплатину и показывает, что 5Z7 обращает резистентность, нацеливаясь на TAK1, чтобы координировать регуляцию сигнальных путей NF-κB/p53, что открывает основу для потенциальной клинической трансляции.