Обогащение убиквитинированных белков из сложных образцов с помощью сортазы

Листки плазматической мембраны, созданные с помощью контролируемого механического разрушения, обеспечивают прямой доступ к цитозольной стороне плазматической мембраны при сохранении родной организации мембраноассоциированных белков и липидов. Здесь мы представляем протокол для генерации и валидации листков плазматической мембраны, полученных с использованием соникации, из культур клеток, первичных нейронов и изолированных синаптосом. Мы также описываем их применение для живой и фиксированной визуализации локализации мембранных белков, их организации, конформационной динамики и взаимодействий белков, а также количественных испытаний рекрутирования мембраноассоциированных синаптических пузырьков. Эта универсальная платформа сохраняет родную среду мембраны и одновременно позволяет проводить прямую визуализацию и количественный анализ мембраноассоциированных процессов с высоким пространственным разрешением. Протокол может быть легко адаптирован для изучения различных мембранных белков, зависимых от липидов механизмов и событий, связанных с прикреплением пузырьков, в широком круге клеточных систем.

Интрогрессия от несampled гоминидных линий стала все более важным элементом истории человеческой эволюции. Недавние исследования показывают, что глубоко отличающиеся линии гоминид могли внести предковую составляющую либо непосредственно в современного человека, либо косвенно через интрогрессию от денисовцев, в то время как выводы остаются сложными из-за нехватки эталонных геномов, слабого сигнала и неопределенности в реконструкции глубоких генеалогий. Мы показываем аналитически и с помощью симуляций, что интрогрессия, опосредованная денисовцами, производит предсказуемые изменения в локальной коалиционной глубине, которые можно приблизительно оценить с помощью масштабируемых обобщенных статистик, в частности парной последовательной дивергенции, что указывает на то, что значительная информация о глубоко различающемся предке сохраняется в вариациях последовательностей без явной реконструкции генеалогий. Используя этот инсайт, мы разрабатываем DEEP (Точная оценка глубокого предка с использованием эффективных прокси), нейросетевую структуру без ARG для выявления кандидатных регионов суперархайческого предка. DEEP сохраняет обнаружимую мощность при низких уровнях ложных позитивов в широком диапазоне демографических параметров, остается масштабируемым и восстанавливает сигналы из небольших выборок. Применяя DEEP к океанийцам, тибетцам и ханьцзам, мы определяем примерно 0,4–0,6 % геномных окон с доказательствами суперархайческого предка. Кандидатные регионы показывают как значительное наложение, так и заметную неоднородность между популяциями, с повторным обогащением вблизи локуса HLA во всех популяциях, что указывает на то, что иммунные регионы повторно сохраняют глубоко различающуюся предковую составляющую.

Флуоресцентная микроскопия со световым листом (LSFM) произвела революцию в биологическом изображении, обеспечивая высокое пространственное и временное разрешение с минимальным фотоповреждением. Тем не менее, традиционные методы LSFM часто страдают от полосатых артефактов в получаемых изображениях из-за рассеяния и поглощения света в образцах, что приводит к неравномерному освещению и негативно сказывается на точности последующего анализа изображений. Чтобы решить эту проблему, мы представляем додекагонную флуоресцентную микроскопию со световым листом (dodecaLSFM) — новый подход, который максимизирует угловое разнообразие для достижения однородного освещения и подавления полосатых артефактов. DodecaLSFM использует дифракционную оптику и цилиндрические линзы для генерации двенадцати световых листов, обеспечивая всенаправленное освещение на 360 градусов, что значительно улучшает однородность освещения по сравнению с традиционными системами mSPIM, mDSLM и ультромикроскопии, которые используют только одну или две плоскости освещения. Мы продемонстрировали эффективность dodecaLSFM, достигнув высокоразрешающего изображения всей сосудистой системы мозга мыши после очищения ткани, что позволяет проводить точный морфометрический анализ сосудистых сетей без полосатых артефактов. Более того, мы показываем, что сочетание dodecaLSFM с расширенной микроскопией (ExM) обеспечивает 3D-изображение целого органа с клеточным разрешением. Этот новый подход предлагает усовершенствованное и масштабируемое решение для объёмной микроскопии, способствуя детальным структурным и функциональным исследованиям в разнообразных биологических приложениях.

Дефицит митохондриальной углеродной анхидразы VA (CA-VA) — редкое наследственное метаболическое расстройство, вызванное биаллельными вариантами гена. Он проявляется гипераммониемией, молочной кислотой и кетонурией, с гипогликемией или без неё. В данном исследовании мы представляем долгосрочное наблюдение за первыми двумя сообщенными случаями дефицита CA-VA: 16-летней женщиной (случай 1) и её 14-летним братом (случай 2), оба из которых проявили себя с неонатальной гипераммониемической энцефалопатией, гипогликемией, повышенным уровнем лактата, кетонурией и компенсированной метаболической ацидозом. Диагноз был установлен в обоих случаях с помощью исследования TIDEX, которое выявило гомозиготный патогенный вариант в гене (c.697T>C, (p.Ser233Pro)). Клиническое течение индексной пациентки показало три дополнительных эпизода метаболической декомпенсации (MDE), вызванных сопутствующими заболеваниями, последний из которых произошёл в 8 лет, что подчеркивает необычное время возникновения её MDE по сравнению с ранее сообщёнными случаями. Случай 2 остался метаболически стабильным без дополнительных MDE. Эти эпизоды успешно лечились парентеральной глюкозой, одной дозой энтеральной карглумической кислоты и время от времени парентеральными липидами. Управление сопутствующим заболеванием включало формулу для

Дисрегуляция фибробластов способствует патологической фиброзе и аномальному восстановлению. Новые данные свидетельствуют о том, что фибробласты накапливаются в поражениях после повреждения центральной нервной системы, но неясно, каким образом они влияют на восстановительные реакции олигодендроцитов, особенно в условиях старения. В данной работе мы сообщаем, что фибробласты накапливаются в паренхиме белого вещества спинного мозга молодыми мышами в возрасте 6–10 недель после демиелинизации, вызванной лиозолецитином. Это было впервые зафиксировано с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии с использованием нескольких маркеров, относящихся к фибробластам, включая тромбоцитарный фактор роста-{бета}, коллаген тип 11, гладкомышечный актин, периостин и фибронектин; а также с использованием трансгенных мышей с отчетчиком TdTomato на основе тромбоцитарного фактора роста-{бета}. Одноядерная и пространственная транскриптомика поражений, вызванных лиозолецитином, установила наличие фибробластов в этих поражениях и выделила их из близкородственных перицитов. Анализ лиганды-рецепторы CellChat подчеркивает фибробласты в среде лиозолецитина как основной источник сигналов для микроглии/макрофагов и предшественников олигодендроцитов, с множеством взаимных взаимодействий. Проникновение фибробластов было стимулировано микроглией/макрофагами, как и ожидалось из их временного представления в поражениях, вызванных лиозолецитином, и из экспериментов в культуре тканей, где миграция фибробластов была усилена макрофагами. Особую значимость для спонтанных регенеративных событий при демиелинизации, вызванной лиозолецитином, имеет то, что области накопления фибробластов были свободны от предшественников олигодендроцитов. В культуре тканей предшественники олигодендроцитов не могли проникнуть в области фибробластов. Более того, накопление фибробластов после травмы, вызванной лиозолецитином, усиливается с увеличением возраста, что является известным фактором, препятствующим способности к ремиелинизации после травмы, и исключение предшественников олигодендроцитов из областей фибробластов у мышей в возрасте 48–52 недель превышает показатели у более молодых животных в возрасте 6–10 недель. Наконец, при анализе общедоступной базы данных одноядерной РНК при рассеянном склерозе мы обнаружили фибробласты на краях хронически активных и хронически неактивных поражений, а также в их центрах, но в меньшем количестве в перифокальных или нормальных белых веществах. Мы выявили несколько сетей коммуникации между фибробластами, микроглией/макрофагами и предшественниками олигодендроцитов в этих поражениях при рассеянном склерозе. Наши коллективные результаты демонстрируют роль фибробластов в невропатологии, ассоциированной с демиелинизацией, которая усугубляется старением, и подчеркивают важность регулирования фибробластов для содействия эффективному восстановлению центральной нервной системы.

Механочувствительные каналы большого проводимости (MscL) являются жизненно важными защитными клапанами бактерий, предотвращающими осмотическую лизу путем высвобождения солей в ответ на напряжение мембраны. Несмотря на обширные функциональные исследования Escherichia coli MscL (EcMscL), его структура в высоком разрешении оставалась неизвестной. Используя крио-электронную микроскопию, мы представляем экспериментальную структуру EcMscL, восстановленного в нано-дисках с разрешением 3.1 Å. Структура демонстрирует пентамерную сборку с узкими гидрофобными воротами на цитозольной стороне и периплазматической полостью, что соответствует канонической конфигурации MscL. Отличия от ранее опубликованных кристаллических структур MscL от других организмов находятся в менее консервативной периплазматической петле. Мы наблюдаем ранее не описанную димерную ассоциацию пентамеров EcMscL, опосредованную остатками 61-63 в периплазматической петле. Этот димерный интерфейс расположен на периплазматической стороне и предоставляет структурную основу для образования кластеров более высокого порядка. Наблюдаемая компоновка позволяет получить жидкоподобную, мозаичную упаковку каналов с центровыми расстояниями 5.9-9 нм, что соответствует биофизическим и визуализационным данным. Эти находки предоставляют структурную основу для понимания организации кластеров EcMscL, которые модулируют его активность в ответ на клеточный стресс.