Додекагонная флуоресцентная микроскопия со световым листом для объёмного отображения без полосатых артефактов

Листки плазматической мембраны, созданные с помощью контролируемого механического разрушения, обеспечивают прямой доступ к цитозольной стороне плазматической мембраны при сохранении родной организации мембраноассоциированных белков и липидов. Здесь мы представляем протокол для генерации и валидации листков плазматической мембраны, полученных с использованием соникации, из культур клеток, первичных нейронов и изолированных синаптосом. Мы также описываем их применение для живой и фиксированной визуализации локализации мембранных белков, их организации, конформационной динамики и взаимодействий белков, а также количественных испытаний рекрутирования мембраноассоциированных синаптических пузырьков. Эта универсальная платформа сохраняет родную среду мембраны и одновременно позволяет проводить прямую визуализацию и количественный анализ мембраноассоциированных процессов с высоким пространственным разрешением. Протокол может быть легко адаптирован для изучения различных мембранных белков, зависимых от липидов механизмов и событий, связанных с прикреплением пузырьков, в широком круге клеточных систем.

По сравнению с традиционными грубыми объемными показателями, модели, основанные на поверхности, обеспечивают большую пространственную точность для понимания изменений в мозге, связанных с развитием, неврологическими и психиатрическими расстройствах. Глобальные инициативы по исследованию мозга объединяют данные со всего мира, чтобы обнаружить и улучшить маркеры мозга, связанные с болезнями. Здесь мы представляем инструментарий для анализа 3D-геометрии мозга, направленный на решение ключевых задач, стоящих перед крупномасштабными исследованиями нейровизуализации. Наша структура включает масштабируемые методы для интеграции многосайтовых данных, коррекции специфичных для сайта искажений, ускоренного статистического моделирования, интерпретируемого машинного обучения и интерактивной визуализации результатов. Инструментарий был протестирован на данных из 21 независимой выборки, участвующей в Рабочей группе по биполярному расстройству ENIGMA (N = 3,373). По сравнению с традиционными объемными характеристиками мы показываем, как меры формы подкорковых структур могут быть объединены по сайтам исследования для выявления пространственно сложных различий между диагностическими группами и их связью с общими методами лечения. Статистическое моделирование было ускорено с использованием алгоритма быстрого и эффективного смешанного эффекта (FEMA) и достигнуто сокращение времени вычисления в 16 раз по сравнению с традиционными подходами. Модели машинного обучения показали, что характеристики формы могут обеспечить большую предсказательную эффективность по сравнению с традиционными объемными данными как для задач диагностики, так и для прогнозирования лечения, при этом интерпретируемые карты весов предоставляют информацию о локальных признаках, определяющих эффективность модели.

Уточнение взаимосвязи между структурой и функцией важно для понимания работы мозга. В Drosophila melanogaster доступны данные о соединениях, полученные с помощью электронной микроскопии на основе FlyEM и FlyWire, а также данные о кальциевом изображении всего мозга. Мы применили методы предварительной обработки из функциональной магнитно-резонансной томографии (фМРТ) к данным о кальциевом изображении всего мозга и всесторонне исследовали оптимальные параметры. Затем мы обнаружили, что корреляция между функциональной и структурной связностью (FC-SC) линейно снижается с увеличением количества регионов интереса, и эта тенденция была одинаковой как у мушек, так и у людей. Мы также разработали новый, более надежный метод для количественной оценки степени пред- и постсинаптической сегрегации и исследовали это в мозге мух. Это показало, что многие нейроны имеют несегрегированные синапсы. Мы извлекли высоко несегрегированные синапсы и сравнили их с случайно извлеченными нулевыми матрицами SC. Их корреляция FC-SC была значительно выше, что указывает на то, что эти синапсы хорошо способствуют FC. Напротив, высоко сегрегированные синапсы показали значительно более низкую корреляцию FC-SC и меньше способствуют FC. Нейроны с несегрегированными синапсами, подобные неимпульсным нейронам, распределены по всему мозгу и считаются важными для FC.

Все более растущее количество исследований предполагает связь между активацией иммунной системы и развитием болезни Паркинсона (БП). Предыдущие работы показали, что повторные гастроинтестинальные инфекции с Citrobacter rodentium могут вызывать моторные нарушения, подобные БП, у мышей с нокаутом Pink1 (KO), а также инфильтрацию имунных клеток в мозг. Для лучшего понимания механизмов, лежащих в основе иммунно-опосредованной атаки на мозг в этой модели, мы проверили, достаточно ли легких инфекций для увеличения проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и запуска мозгового воспаления. Мышей Pink1 диких типов (WT) и KO инфицировали C. rodentium, а магнитно-резонансная томография с усилением гадолинием (МРТ) была проведена на 13 и 26 день после инфекции для оценки целостности ГЭБ. Количественный анализ МРТ показал повышение проницаемости ГЭБ на 26 день как у WT, так и у KO мышей, особенно в стриатуме, зубчатой извилине, соматосенсорной коре и таламусе. Примечательно, что эта проницаемость не была связана с изменениями в экспрессии белков плотных контактов или маркеров дофаминовой системы в стриатуме в любой момент времени. Однако на 26 день после инфекции была отмечена постоянная активация микроглии, а также повышение уровней воспалительных медиаторов, таких как еотаксин, IFN-γ, CXCL9, IL-17 и MIP-2 в стриатуме. Кроме того, уровни IL-17 и CXCL1 в сыворотке были повышены у инфицированных мышей Pink1 KO. Цитометрия потока показала инфильтрацию нейтрофилов в мозг на 26 день после инфекции. Наконец, анализ транскриптома с использованием bulk RNA-seq показал, что генетические наборы, связанные с синаптической функцией, были особенно подвержены влиянию инфекции, и что гены, связанные с воспалением, были регуляторно повышены инфекцией у мышей Pink1 KO. Эти результаты поддерживают гипотезу о том, что даже легкие гастроинтестинальные инфекции могут увеличить проницаемость ГЭБ, нарушить гомеостаз мозга и способствовать хроническому нейровоспалению. У генетически восприимчивых индивидов, таких как лица с дефицитом Pink1, это может представлять собой первый удар, который способствует последующей индукции патологии БП в процессе старения.

Целью исследования было выявление предикторов слуховой функции у пациентов с не леченой вестибулярной шванномой (ВС), учитывая возрастные потери слуха, а также изучение базовых объемных и аудиометрических характеристик в когорте пациентов, назначенных на стереотаксическую лучевую терапию (СЛТ). Это было популяционное исследование. Исследование проводилось в рамках единой национальной программы направления на СЛТ с использованием проспективной базы данных. В исследование были включены все последующие пациенты с недавно диагностированной односторонней ВС и с полными данными предвмешательствующей визуализации и аудиометрии. Высокодетализированная МРТ и КТ костей с ко-регистрацией и слиянием позволили провести морфометрический и объемный анализ размеров ВС и внутреннего слухового канала (ИСК). Были проведены одновариантные тесты, многовариантная логистическая регрессия с взаимодействиями и регуляризованная регрессия для выявления факторов, связанных с сохранением слуха (баллы Гарднера-Робертсона 1-2). Среди 533 пациентов (50.65% мужчин, средний возраст 57.04 года) 72.6% имели сохраненный слух. Медианный объем ВС составил 875.3 мм (IQR: 328.6-1732.5). В финальной многовариантной модели (AUC = 0.719) остались значимыми возраст (OR = 0.920, p = .0144), коэффициент заполнения канала (КЗК; OR = 0.465, p = .0446) и значительное взаимодействие возраста × коэффициент отношения объема внутреннего канала к общему объему опухоли (p = .0318). Анализы по возрастным группам показали, что взаимосвязь между КЗК и слухом менялась в зависимости от возраста: у более молодых пациентов (<40 лет) более высокий коэффициент заполнения канала был связан с лучшим сохранением слуха (94% против 73%), в то время как эта закономерность менялась у пожилых пациентов (>60 лет). Более молодые пациенты также продемонстрировали большее расширение канала (p = .002), хотя это не имело независимой предсказательной ценности (p = .366). Хотя возраст имеет решающее значение в прогнозировании слуха при ВС, коэффициент заполнения канала значительно модифицирует эту взаимосвязь в зависимости от возраста, представляя собой клинически доступный биомаркер визуализации с возрастными порогами и эффектами.

Механочувствительные каналы большого проводимости (MscL) являются жизненно важными защитными клапанами бактерий, предотвращающими осмотическую лизу путем высвобождения солей в ответ на напряжение мембраны. Несмотря на обширные функциональные исследования Escherichia coli MscL (EcMscL), его структура в высоком разрешении оставалась неизвестной. Используя крио-электронную микроскопию, мы представляем экспериментальную структуру EcMscL, восстановленного в нано-дисках с разрешением 3.1 Å. Структура демонстрирует пентамерную сборку с узкими гидрофобными воротами на цитозольной стороне и периплазматической полостью, что соответствует канонической конфигурации MscL. Отличия от ранее опубликованных кристаллических структур MscL от других организмов находятся в менее консервативной периплазматической петле. Мы наблюдаем ранее не описанную димерную ассоциацию пентамеров EcMscL, опосредованную остатками 61-63 в периплазматической петле. Этот димерный интерфейс расположен на периплазматической стороне и предоставляет структурную основу для образования кластеров более высокого порядка. Наблюдаемая компоновка позволяет получить жидкоподобную, мозаичную упаковку каналов с центровыми расстояниями 5.9-9 нм, что соответствует биофизическим и визуализационным данным. Эти находки предоставляют структурную основу для понимания организации кластеров EcMscL, которые модулируют его активность в ответ на клеточный стресс.