Секретируемый пептид, подобный AIP, подавляет систему кворум-сенсинга Agr

Представление пептидов, полученных от патогенов, классом I HLA, является необходимым условием для распознавания CD8+ T-клетками. Хотя уже документированы лиганды MHC, лигандом в ходе прогрессирования инфекции остается слабо охарактеризованным. В данной работе мы использовали основанный на МС подход к иммунопептидомике для прямого профилирования иммунопептидома, представленного HLA-A*02:01 у трансгенных мышей. Применяя иерархическую воронку открытий, наш анализ идентифицировал обширный репертуар из 3744 уникально полученных пептидов. Последующая фильтрация для канонических пептидов длиной 8-12 аминокислот, соответствующих типичной длине связывания для лигандов HLA-A*02:01, установила высоконадежный основополагающий лигандом из 3433 пептидов. Анализ исходных белков показал, что эти пептиды происходят из различных белков паразитов, включая значительную долю неохарактеризованных гипотетических белков. Примечательно, что специфические лиганды последовательно определялись как на острых, так и на хронических стадиях, что предполагает стабильное представление MHC-I на протяжении всего цикла инфекции. Интегрируя предсказания с экспериментальной валидацией, мы приоритизировали 73 кандидата с высокой аффинностью, пять из которых продемонстрировали устойчивую способность связываться с HLA-A*02:01. В частности, мы идентифицировали новый лиганд, полученный из гликогенсинтазы (PGS), и определили его структуру кристаллов с HLA-A*02:01, выявив благоприятную архитектуру связывания. В целом, эти результаты расширяют известный ландшафт лигандов, ограниченных HLA-A*02:01, и предоставляют список с высоким приоритетом для будущей функциональной валидации иммуногенности CD8+ T-клеток.

Хемокиновые рецепторы играют решающую роль в возникновении и прогрессировании опухолей, однако высокая избыточность между лигандом и их рецепторами ограничивает возможности их терапевтического использования в лечении рака. Чтобы преодолеть это ограничение, мы разработали химерные хемокиновые пептиды, в которых CCL2 и CCL8 были сконъюгированы с токсином дифтерии (DT) и оценили их противоопухолевую активность. Цитотоксические пептиды DTCCL2 и DTCCL8 были получены в виде рекомбинантных белков, и их противораковая активность была протестирована на клеточных культурах и у мышей с опухолями. Употребление цитотоксических аналогов оценивалось до и после терапии в опухолевых эксплантатах. Оба аналога были цитотоксичны для клеток рака молочной железы in vitro и продемонстрировали значительную противоопухолевую активность in vivo у мышей, несущих человеческие линии рака молочной железы и ксенографты, полученные от пациентов с гормон-негативным раком молочной железы (PDXs). In vitro пептидные конъюгаты показывали перекрывающиеся профили захвата, при этом около 80% клеток рака молочной железы были положительными для обоих пептидов, и около 15%-20% клеток были отрицательными для одного из пептидных цитотоксиков или для обоих. В опухолевых эксплантатах, культивируемых ex vivo, одновременная положительность для DTCCL2 и DTCCL8 возросла до более 95%, при менее чем 5% клеток, не показывающих ни DTCCL8, ни DTCCL2. Лечение мышей с опухолями молочной железы пептидами DTCCL8 или DTCCL2 значительно тормозило рост опухоли и продлевало выживание в модели PDX. Эти результаты подтверждают возможность использования цитотоксических пептидных конъюгатов для лечения рака молочной железы и показывают, что профили экспрессии рецепторов in vitro не точно предсказывают опухолевую положительность.

EGFR L858R — это активирующая мутация, связанная с аномальным сигналингом EGFR, и молекулы, способные распознавать этот мутант, продолжают быть предметом исследований. В данном исследовании была проведена скрининговая оценка виртуальной библиотеки пептидов, содержащей 59 319 гептапептидов, с использованием кристаллической структуры EGFR L858R, что привело к выявлению четырех пептидов с благоприятными прогнозируемыми способностями к связыванию. Среди них Пептид-1 показал наибольшую аффинность связывания в исследованиях MST (= 0,35 ± 0,02 μM), что превышает аффинность референтного пептида DTP-1. Интегрированные структурные и динамические анализы продемонстрировали, что Пептид-1 может формировать относительно стабильную конформацию связывания с EGFR L858R. Пептид-1 снижал жизнеспособность клеток SKOV3, OVCAR3 и CaOV3, показывал более слабые эффекты на клетках IOSE-80, а его активность была значительно ослаблена после трансдукции shRNA, нацеленному на EGFR. Кроме того, Пептид-1 уменьшал экспрессию мРНК Cyclin D1 и увеличивал экспрессию мРНК Caspase-3. Эти результаты указывают на то, что Пептид-1 может быть дополнительно исследован как пептид, нацеленный на EGFR L858R.

В то время как большинство существующих методов ограничивается предсказанием третичной структуры белков, содержащих только канонические остатки, сервер PEPstrMOD (разработанный в 2015 году) стал пионером в предсказании структуры химически модифицированных и неестественных пептидов. Несмотря на широкое использование, первоначальная система была ограничена пептидами длиной от 7 до 25 остатков и полагалась на устаревшие алгоритмы предсказания спинальных структур. Чтобы устранить эти ограничения, мы представляем PEPstrMOD2, который предлагает три основных усовершенствования по сравнению с предшественником. Во-первых, он заменяет оригинальную генерацию координат высококачественными алгоритмами глубокого обучения, используя AlphaFold2 и ESMFold для высокоточного предсказания начальной структуры. Во-вторых, он значительно расширяет доступное химическое пространство за счет включения новой библиотеки совместимых с силовым полем AMBER, содержащей 257 посттрансляционных модификаций (PTMs), 428 неканонических аминокислот (NCAAs) и 243 терминальных модификаций. Наконец, благодаря применению нативной масштабируемости AlphaFold2 и ESMFold, PEPstrMOD2 устраняет оригинальные ограничения по длине, позволяя структурное моделирование более длинных и сложных терапевтических пептидов и малых белков. Мы оценили производительность PEPstrMOD2 по сравнению с современными методами на трех различных наборах данных пептидов. Для набора данных AfCyc, состоящего из 80 циклических пептидов, PEPstrMOD2 продемонстрировал конкурентоспособное среднее значение отклонения корня среднеквадратичного (RMSD) 2.05 Å по сравнению с 1.13 Å от AlphaFold3 и 1.82 Å от AfCycDesign. Примечательно, что для набора модифицированных пептидов ModPep433 PEPstrMOD2 превзошел AlphaFold3, достигнув более низкого среднего RMSD 4.49 Å против 4.67 Å у AlphaFold3. Кроме того, в случае эталона ModPep16 PEPstrMOD2 достиг среднего RMSD 2.50 Å, что в два раза точнее показателя оригинального PEPstrMOD (5.84 Å). В заключение, PEPstrMOD2 предоставляет мощную, высокопроизводительную и высокоточную платформу для содействия разработке пептидных лекарств и исследованиям в области структурной биологии. В то время как оригинальный PEPstrMOD был ограничен интерфейсом веб-сервера, PEPstrMOD2 доступен как интуитивно понятный веб-сервер, так и как самостоятельный инструмент командной строки через GitHub, предлагая поддержку Docker для простой развертки и воспроизводимых, крупномасштабных моделей (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/pepstrmod/). Основные моменты: PEPstrMOD2 предсказывает структуры химически модифицированных пептидов с использованием глубокого обучения и уточнения молекулярной динамики. Поддерживает 928 химических модификаций через пользовательские библиотеки силового поля AMBER, включая PTMs, NCAAs, терминальные, D- и циклические модификации. Устраняет ограничения по длине пептидов благодаря интеграции AlphaFold2 и ESMFold. Превосходит PEPstrMOD и конкурентоспособен с AlphaFold3 на различных эталонных наборах данных. Доступен как веб-сервер и самостоятельная платформа через GitHub и Docker.

Активация STING, индуцированная cGAMP, способствует воспалительным и интерфероновым сигналам, что делает STING актуальной мишенью для разработки ингибиторов. В этом исследовании была проведена проверка библиотеки пептидов из 59 319 последовательностей на взаимодействие со STING с помощью молекулярного докинга, и были выбраны четыре наилучших пептида для дальнейшей оценки. Анализ MST показал, что пептиды 1-4 связываются с рекомбинантным STING, при этом пептид-1 продемонстрировал наивысшую аффинность (0.15 ± 0.01 μM). Анализы докинга и моделирования показали, что связывание опосредовано водородными связями и гидрофобными контактами. Молекулярная динамика, анализ MM/PBSA и ландшафта свободной энергии предполагают стабильное связывание с благоприятными расчетными энергетическими характеристиками. Пептид-1 не проявлял очевидной цитотоксичности до концентрации 10 μM в макрофагах RAW264.7 и первичных BMDM, при этом дозозависимо снижал экспрессию IFN-β и IL-6, индуцированную cGAMP, как на уровне белка, так и на уровне мРНК. Этот ингибирующий эффект сопровождался снижением фосфорилирования STING и IRF3. В совокупности эти результаты предполагают, что пептид-1 может связываться со STING и ослаблять экспрессию IFN-β и IL-6, индуцированную cGAMP.

Является основным зоонозным патогеном, вызывающим у людей фульминантный менингит и синдром, подобный стрептококковому токсическому шоку (STSLS). Последний обусловлен дисрегулированными воспалительными реакциями и взрывными цитокиновыми штормами. Остается неясным, действует ли PANoptosis как согласованная защитная реакция хозяина или же служит вредным фактором, провоцирующим цитокиновый шторм во время бактериальной инфекции. В данном исследовании мы выявляем аутофагию как верховного организатора PANoptosis во время зоонозной инфекции, переопределяя STSLS как болезнь, управляемую интегрированной программой клеточной смерти PANoptosis, а не параллельной активацией отдельных путей смерти. Механистически инфекция активирует метаболический путь iNOS/NO-Bcl-2-ауттофагия, который, в свою очередь, устанавливает PANoptosis в качестве доминирующего драйвера цитокинового шторма и повреждения хозяина. Нокаут iNOS, осуществленный с помощью CRISPR/Cas9 in vitro, вместе с ингибированием iNOS/NO с использованием селективного ингибитора 1400 W, заметно подавляет индуцированную аутофагией PANoptosis, ослабляет цитокиновые штормы и защищает мышей от летального STSLS, тем самым устанавливая PANoptosis как центральный драйвер повреждения хозяина в патологии STSLS. В этом исследовании мы раскрываем аутофагию как ранее нераспознанный верховный регулятор PANoptosis и выделяем путь iNOS/NO-ауттофагия как ключевую точку для PANoptosis и разумную мишень для терапии, направленной на хозяина, в случае STSLS.