Высокоточная флуоресцентно-направленная крио-фокусная ионно-лучевая фрезеровка

Экстрацеллюлярные везикулы (ЭВ) стали многообещающим средством для доставки лекарств и терапии заболеваний благодаря своей врожденной биосовместимости и способности переносить функциональные биомолекулы. Однако ограничения существующих технологий хранения, включая структурную деградацию и потерю биологической активности во время длительного замораживания, а также несовместимость традиционных криозащитников, таких как ДМСО и глицерин, с внутривенным введением, создают серьезные барьеры для клинического применения. В этой работе мы разработали DDAS, формулировку биомиметического криозащитного агента, рационально спроектированного с использованием методов генеративного искусственного интеллекта (ГИИ) для приоритизации физиологически релевантных кандидатов из Базы данных метаболомов человека. DDAS состоит из декстрана, альбумина и салициловой кислоты, которые были выбраны за их синергетическую стабилизацию и врожденную биосовместимость. В сравнении с стандартными средами для хранения, DDAS значительно улучшила стабильность ЭВ во время продолжительной криоконсервации и многократных циклов замораживания-оттаивания, эффективно сохраняя морфологию везикул, концентрацию частиц и функциональность белков нагрузки, одновременно снижая агрегацию и повреждение мембраны. Особенно важно, что DDAS продемонстрировала незначительную цитотоксичность и отличную биосовместимость, позволяя проводить прямое внутривенное введение без повторной изоляции или промывания. Важно, что ЭВ, полученные из стволовых клеток и сохраненные в DDAS, полностью сохранили свою терапевтическую активность in vivo, значительно снижая воспаление и ускоряя заживление ран после системного введения. Таким образом, данное исследование разрабатывает и подтверждает DDAS, практический и клинически приемлемый биомиметический криозащитный агент, основанный на методах ГИИ. DDAS позволяет долговременное хранение ЭВ с сохранением их функциональности и значительно усиливает терапевтическую эффективность ЭВ стволовых клеток в заживлении ран, в конечном итоге раскрывая их полный клинический потенциал.

Сопоставление наноразмерной архитектуры тканей с необъективным молекулярным составом в одном и том же образце остается важной задачей в пространственной биологии. Современные методы пространственной протеомики либо не обладают разрешением изображения, необходимым для различения наноразмерной архитектуры тканей, либо обеспечивают лишь ограниченное покрытие протеома, а нецелевая протеомика, способная на глубокую идентификацию белков, еще не была интегрирована с суперразрешающим изображением в рамках одного рабочего процесса. Здесь мы представляем microProteomEx, интегрированную платформу, которая сочетает расширение тканей с помощью гидрогеля с флуоресцентной имиджингом, совместимым с масс-спектрометрией, лазерной микроиссечением и протеомикой с нижним входом для достижения одновременного трехмерного суперразрешающего изображения (эффективное боковое разрешение до ~47 нм на обычных микроскопах с ограничением дифракции) и пространственно разрешенной протеомики при масштабируемом боковом разрешении 29-100 мкм (0.02-0.28 нл объемного разрешения). Оптимизируя фиксацию, якорение белков и вторичную стратегию повторного встраивания, мы расширяем метод до механически стойких тканей, включая почки и сердце мыши, а также до клинических образцов, зафиксированных формальдегидом и обработанных парафином. Мы демонстрируем протеомику однослойного клубочка и отдельной бляшки (450-1000 белков на структуру), выявляем протеомные различия между злокачественной меланомой и гигантской врожденной меланоцитарной невусом в редком педиатрическом случае, а также характеризуем морфологически разрешенную молекулярную гетерогенность корковой и диффузной бляшек амилоид-бета в мышином модели болезни Альцгеймера на двух стадиях болезни. MicroProteomEx устанавливает широко доступную основу для коррелирования ультраструктуры тканей с глубокой пространственной протеомикой, с прямыми последствиями для биологии заболеваний, открытия биомаркеров и персонализированной медицины.

Протяженные структуры тела развивались многократно у животных, однако механизмы, лежащие в основе развертывания таких органов, часто остаются неизвестными. Личинки мух-эриталин (мух с длинным хвостом) обладают чрезмерно удлинёнными задними дыхательными сифонами, однако механизм их продления не был экспериментально исследован. В этом исследовании, используя пойманные в дикой природе личинки Helophilus virgatus, мы показали, что продление заднего сифона достигается через механизм складывания и раскладывания, выявленный с помощью флуоресцентной маркировки. Окрашивание фаллоидином также показало, что, в отличие от Episyrphus sp. и Drosophila melanogaster, H. virgatus обладает плотной сетью поперечно ориентированных мышечных волокон в заднем сифоне. Поведенческий анализ также продемонстрировал, что задний сифон функционирует не только в дыхании, но и как пропульсивный орган для движения у поверхности с помощью ассиметричного гребка. В целом, наши результаты определяют структурные и кинематические основы развертывания заднего сифона и демонстрируют, как специализированный дыхательный орган может эволюционировать в многофункциональный придаток, который поддерживает как дыхание, так и локомоцию.

Это исследование направлено на использование метода менделевской рандомизации на основе обобщенных данных (SMR) для изучения потенциальных ассоциаций, связывающих митохондриально-ассоциированные гены с острым повреждением почек (ОПП) и хронической болезнью почек (ХБП). В этом исследовании были использованы митохондриально-ассоциированные гены из базы данных MitoCarta3.0, а также данные о метилировании ДНК (mQTL), экспрессии генов (eQTL) и экспрессии белков (pQTL). Мы получили обобщенную статистику из геномных ассоциационных исследований для ОПП и ХБП из Программы Миллионов Ветеранов США с последующей валидацией в UK Biobank. Метод SMR, дополненный анализом колокализации, использовался для оценки ассоциаций. Мы дополнительно провели валидацию, используя данные eQTL, специфичные для коры почки, из проекта Genotype-Tissue Expression и данные одноклеточной транскриптомики из базы данных KPMP. В открывающих наборах данных анализ SMR выявил 174 mQTL, 64 eQTL и 20 pQTL, ассоциированных с риском ОПП, и 253 mQTL, 80 eQTL и 23 pQTL, ассоциированных с риском ХБП. Всего было идентифицировано 32 mQTL, 16 eQTL и 9 pQTL как общие сигналы, связанные как с риском ОПП, так и с риском ХБП. В частности, были выявлены значительные ассоциации как для ОПП, так и для ХБП, в то время как другие сигналы были специфичны для ХБП. Примечательно, что был идентифицирован общий ген как фактор риска как для ОПП, так и для ХБП в тканях коры почки. Более того, был подтвержден как потенциально защитный фактор для ХБП, хотя размер эффекта был скромным (OR 0.95, 95% CI 0.90-1.00). Это исследование использовало метод SMR для определения потенциальных генов риска и защиты для ОПП и ХБП, что выявило молекулярную связь между митохондриально-ассоциированными генами и почечной недостаточностью.

Бессимптомные инфекции поддерживаютTransmission и препятствуют усилиям по искоренению, однако эти скрытые резервы избегают текущей диагностики. Здесь мы интегрировали вычислительную иммунологию с эмпирической серологией, чтобы открыть высокоэффективные эпитопы В-лимфоцитов. Из библиотеки из 142 белков мы приоритизировали шесть антигенов (AMA1, CSP, DBP, MSP1, MSP9 и P12), синтезировали 64 эпитопа и протестировали их против сыворотки от случаев инфекции из пограничной зоны между Китаем и Мьянмой (CMB) с помощью ELISA, с последующей валидацией мультиплексного иммуноанализа по образцам из Бразилии, Соломоновых Островов и Папуа - Новой Гвинеи. Строгая оценка специфичности, чувствительности и различения бессимптомных инфекций, наряду с анализами антигенной консервации в клинических изолятах CMB и глобальных гомологах, привела к выявлению десяти иммунодоминантных эпитопов. Четыре из них показали выдающиеся результаты, а именно, MSP9 (90,4% чувствительности, AUC = 0,980), AMA1 (AUC = 0,910), MSP9 (AUC = 0,802) и MSP9 (AUC = 0,898), все с абсолютной специфичностью против (< 0,0001). Критически важно, что эпитоп MSP9 отличал бессимптомные инфекции (AUC = 0,756, < 0,0005). Несмотря на переменные уровни обнаружения в разных регионах (2,2-22,2%), с максимальными показателями в Бразилии, все эпитопы оставались 99-100% консервативными в глобальном масштабе, что отражает сильные функциональные иммунологические ограничения. Эти эпитопы обеспечивают беспрецедентное выявление как симптоматических, так и бессимптомных инфекций - заполняя критическую пробел в мониторинге - в то время как их масштабируемость и видовая специфичность делают их идеальными для кампаний по ликвидации, особенно в условиях ограниченных ресурсов. Эта работа закладывает основу для инструментов следующего поколения для серологического мониторинга, чтобы ускорить искоренение малярии вивакса.

TMEM16A является анионным каналом, активируемым Ca2+, который обеспечивает прямую электрическую обратную связь с плазматической мембраной в ответ на внутренний Ca2+. Его проводящее состояние остается неясным, что порождает вопросы о открытии, проницаемости для Cl- и модуляции со стороны Ca2+, деполяризации и липидов. Чтобы исследовать открытое состояние, мы провели молекулярно-динамические симуляции TMEM16A, связанного с предполагаемым блокатором открытого состояния 1PBC. После удаления ингибитора предполагаемая спираль, образующая пору TM4, развила изломы в двух местах: верхнем, который открывает пору для проницаемости Cl-, и более глубоком, вызывающем сужение. Сохранившаяся гидрофобная сеть между TM3 и TM4 присутствовала в большинстве открытых структур, но разъединилась во время экстремального расширения, что позволило липидам временно блокировать пору. Записи с использованием метода патч-кламп показывают, что целостная сеть способствует активации. Дополнительные симуляции выявили более 60 событий проницаемости для Cl- и одноканальную проводимость, совпадающую с экспериментом. Дополнительное электростатическое и кинетическое моделирование показало, что переход TMEM16A от выхода rectification к омической проводимости с увеличением Ca2+ обусловлен слабой зависимостью напряжения от связывания ионов Ca2+, которые действуют кооперативно, чтобы открыть пору.