Острая in vivo ближняя маркировка для протеомики, нацеленной на мембраны в нейронных цепях

Сопоставление наноразмерной архитектуры тканей с необъективным молекулярным составом в одном и том же образце остается важной задачей в пространственной биологии. Современные методы пространственной протеомики либо не обладают разрешением изображения, необходимым для различения наноразмерной архитектуры тканей, либо обеспечивают лишь ограниченное покрытие протеома, а нецелевая протеомика, способная на глубокую идентификацию белков, еще не была интегрирована с суперразрешающим изображением в рамках одного рабочего процесса. Здесь мы представляем microProteomEx, интегрированную платформу, которая сочетает расширение тканей с помощью гидрогеля с флуоресцентной имиджингом, совместимым с масс-спектрометрией, лазерной микроиссечением и протеомикой с нижним входом для достижения одновременного трехмерного суперразрешающего изображения (эффективное боковое разрешение до ~47 нм на обычных микроскопах с ограничением дифракции) и пространственно разрешенной протеомики при масштабируемом боковом разрешении 29-100 мкм (0.02-0.28 нл объемного разрешения). Оптимизируя фиксацию, якорение белков и вторичную стратегию повторного встраивания, мы расширяем метод до механически стойких тканей, включая почки и сердце мыши, а также до клинических образцов, зафиксированных формальдегидом и обработанных парафином. Мы демонстрируем протеомику однослойного клубочка и отдельной бляшки (450-1000 белков на структуру), выявляем протеомные различия между злокачественной меланомой и гигантской врожденной меланоцитарной невусом в редком педиатрическом случае, а также характеризуем морфологически разрешенную молекулярную гетерогенность корковой и диффузной бляшек амилоид-бета в мышином модели болезни Альцгеймера на двух стадиях болезни. MicroProteomEx устанавливает широко доступную основу для коррелирования ультраструктуры тканей с глубокой пространственной протеомикой, с прямыми последствиями для биологии заболеваний, открытия биомаркеров и персонализированной медицины.

Хемокиновые рецепторы играют решающую роль в возникновении и прогрессировании опухолей, однако высокая избыточность между лигандом и их рецепторами ограничивает возможности их терапевтического использования в лечении рака. Чтобы преодолеть это ограничение, мы разработали химерные хемокиновые пептиды, в которых CCL2 и CCL8 были сконъюгированы с токсином дифтерии (DT) и оценили их противоопухолевую активность. Цитотоксические пептиды DTCCL2 и DTCCL8 были получены в виде рекомбинантных белков, и их противораковая активность была протестирована на клеточных культурах и у мышей с опухолями. Употребление цитотоксических аналогов оценивалось до и после терапии в опухолевых эксплантатах. Оба аналога были цитотоксичны для клеток рака молочной железы in vitro и продемонстрировали значительную противоопухолевую активность in vivo у мышей, несущих человеческие линии рака молочной железы и ксенографты, полученные от пациентов с гормон-негативным раком молочной железы (PDXs). In vitro пептидные конъюгаты показывали перекрывающиеся профили захвата, при этом около 80% клеток рака молочной железы были положительными для обоих пептидов, и около 15%-20% клеток были отрицательными для одного из пептидных цитотоксиков или для обоих. В опухолевых эксплантатах, культивируемых ex vivo, одновременная положительность для DTCCL2 и DTCCL8 возросла до более 95%, при менее чем 5% клеток, не показывающих ни DTCCL8, ни DTCCL2. Лечение мышей с опухолями молочной железы пептидами DTCCL8 или DTCCL2 значительно тормозило рост опухоли и продлевало выживание в модели PDX. Эти результаты подтверждают возможность использования цитотоксических пептидных конъюгатов для лечения рака молочной железы и показывают, что профили экспрессии рецепторов in vitro не точно предсказывают опухолевую положительность.

Фон: РСВ является одной из основных причин серьезных легочных инфекций у маленьких детей, и более 95% смертей происходят в бедных странах. В Бангладеш высокие уровни заболеваний РСВ среди детей, но отсутствуют генетические данные после пандемии COVID-19. Новые вакцины и антидологические препараты теперь доступны, что делает местную генетическую информацию крайне важной. Цели: Мы секвенировали полные геномы РСВ у пациентов из Бангладеш, чтобы изучить типы вирусов, генетические изменения и мутации белков, и открыто поделились нашими данными. Методы: С августа 2024 по декабрь 2025 года мы собрали 59 образцов с положительным результатом на РСВ с высоким уровнем вируса от пациентов в больницах и секвенировали их полные геномы с использованием технологии Oxford Nanopore. Результаты: Из 11 874 пациентов 1 390 (11,7%) имели РСВ, в основном РСВ-А (94,6%). Мы получили 49 качественных полных геномов из 59 образцов (83% успех): 43 РСВ-А (тип ON1, пять подлиний) и 6 РСВ-Б (тип BA9). Мы обнаружили S276N в 35% РСВ-А и S389P во всех РСВ-Б, но ни одна из этих мутаций не останавливает текущие антидологические лечения. Все вирусы РСВ-А получили новое место присоединения сахара на своем белке F, и большинство вирусов РСВ-Б также получили такое место. Мы загрузили все 49 геномов в GISAID для публичного использования. Заключение: Эта работа демонстрирует возможность полного секвенирования генома РСВ в Бангладеш. Вирусы здесь все еще соответствуют целям новых вакцин и антидологов, что обнадеживает. Наши выводы служат основой для планирования профилактики РСВ в Бангладеш и Южной Азии.

Метилирование ДНК традиционно рассматривается как стабильная эпигенетическая модификация. Однако все больше данных свидетельствует о том, что окислительный и генотоксический стресс могут вызывать изменения метилирования в специфических локусах, которые модифицируют транскрипционные ответы. Вклад такой динамической регуляции в экспрессию сердечных генов при ишемии/реперфузии миокарда (ИРИ) остается до конца непонятным. Это исследование проверило, связаны ли изменения метилирования в области промотора с ремоделированием коннексина 43 (Cx43) при ИРИ. Самцам мышей C57BL/6 был проведен глобальный гипотермический I/R с использованием модели сердца, перфузируемого по Лангендорфу, с предварительной обработкой или без нее с помощью ингибитора ДНК-метилтрансферазы 5-азацитидина (5-Аза, 3 мкг/г массы тела, в/к). Метилирование промотора было проанализировано с помощью BSP и MSP, в то время как обогащение Dnmt1 было оценено с помощью иммуноосаждения хроматина. Экспрессия и локализация Cx43 были изучены с помощью qRT-PCR, вестерн-блоттинга и иммуннофлуоресценции, а также электрофизиологических и гистологических анализов. ИРИ была ассоциирована с повышением уровня Dnmt1 и его обогащением в ядре, что сопровождалось изменениями метилирования в выбранных CpG сайтах в исследуемой области промотора и транскрипционной репрессией. Эти изменения совпали со снижением экспрессии Cx43, изменением субклеточной локализации, нарушением электрической проводимости и повышенной предрасположенностью к аритмиям. Предварительная обработка 5-Аза частично ослабила метилирование промотора и сохранила экспрессию и локализацию Cx43 в процессе последующей ИРИ. Эти результаты поддерживают связь между обогащением Dnmt1, изменением метилирования CpG промотора и ремоделированием Cx43 при реперфузионном стрессе, что предполагает, что метилирование, связанное с эпигенетической регуляцией, может участвовать в транскрипционных реакциях Gja1 при ИРИ. Необходимы дальнейшие временные и геноспецифические валидации, чтобы установить кинетику и причинную специфичность этого пути.

Это исследование направлено на использование метода менделевской рандомизации на основе обобщенных данных (SMR) для изучения потенциальных ассоциаций, связывающих митохондриально-ассоциированные гены с острым повреждением почек (ОПП) и хронической болезнью почек (ХБП). В этом исследовании были использованы митохондриально-ассоциированные гены из базы данных MitoCarta3.0, а также данные о метилировании ДНК (mQTL), экспрессии генов (eQTL) и экспрессии белков (pQTL). Мы получили обобщенную статистику из геномных ассоциационных исследований для ОПП и ХБП из Программы Миллионов Ветеранов США с последующей валидацией в UK Biobank. Метод SMR, дополненный анализом колокализации, использовался для оценки ассоциаций. Мы дополнительно провели валидацию, используя данные eQTL, специфичные для коры почки, из проекта Genotype-Tissue Expression и данные одноклеточной транскриптомики из базы данных KPMP. В открывающих наборах данных анализ SMR выявил 174 mQTL, 64 eQTL и 20 pQTL, ассоциированных с риском ОПП, и 253 mQTL, 80 eQTL и 23 pQTL, ассоциированных с риском ХБП. Всего было идентифицировано 32 mQTL, 16 eQTL и 9 pQTL как общие сигналы, связанные как с риском ОПП, так и с риском ХБП. В частности, были выявлены значительные ассоциации как для ОПП, так и для ХБП, в то время как другие сигналы были специфичны для ХБП. Примечательно, что был идентифицирован общий ген как фактор риска как для ОПП, так и для ХБП в тканях коры почки. Более того, был подтвержден как потенциально защитный фактор для ХБП, хотя размер эффекта был скромным (OR 0.95, 95% CI 0.90-1.00). Это исследование использовало метод SMR для определения потенциальных генов риска и защиты для ОПП и ХБП, что выявило молекулярную связь между митохондриально-ассоциированными генами и почечной недостаточностью.

Электрическая возбудимость у инфузории парамеций связывает сенсорную трансдукцию с поведенческим выходом через вольтозависимый контроль активности ресничек. Несмотря на долгую историю как модели организма, количественная основа, которая могла бы реконструировать градиентную возбудимость мембраны из пересекающихся макроскопических компонентов тока, оставалась неполной. В данной работе мы разработали модель, основанную на проводимости, для Paramecium multimicronucleatum, используя контролируемые протоколы вольт-клипа и анализы типа Ходжкина-Хаксли. Сначала мы охарактеризовали компоненты утечки в состоянии покоя и два основных поздних компонента: компонент, активируемый деполяризацией (Idepo), и компонент, активируемый гиперполяризацией (Ihyper). В совокупности эти компоненты образовали минимум проводимости рядом с потенциалом покоя. Используя эту базовую модель, мы оперативно изолировали переходный внутрьток Ca2+ (ICa). Зависимая от Ca2+ инактивируемость была значительно неэкспоненциальной и описывалась феноменологической параметризацией, связывающей доступность канала с кумулятивным входом Ca2+ во время кондиционирования. Восстановление от инактивируемости было значительно медленнее, чем начало инактивируемости. В конечном итоге мы интегрировали эти параметризованные компоненты в уравнение для одной мембраны и реконструировали градиентные ответы мембраны, наблюдаемые в записях с током. Модель воспроизвела начальный деполяризационный пик и последующую устойчивую деполяризованную фазу, за которой последовала реполяризация. В совокупности эти результаты демонстрируют, что интегрированное кинетическое описание может уловить основные характеристики градиентной возбудимости мембраны у P. multimicronucleatum в существующих условиях записи.