Скрининг насыщенной мутагенеза обратной транскриптазы M-MLV выявляет варианты, увеличивающие эффективность прайм-редактирования

Мирцен является высокоценным монетерпеном, широко применяемым в парфюмерной, пищевой и сельскохозяйственной отраслях, однако его эффективное микробное производство остаётся сложной задачей из-за конкуренции путей и ограниченного метаболического потока. Компартментация предлагает уникальную стратегию для пространственной организации гетерологических метаболических путей, что позволяет улучшить эффективность путей благодаря физическому отделению от конкурирующего цитозольного метаболизма. В этом исследовании мы разработали клеточное ядро как синтетическую метаболическую компартмент для биосинтеза мирцена. Скрининг синтаз мирцена выявил два высокоактивных фермента, которые эффективно функционируют в дрожжах. Производство мирцена было обнаружено только в том случае, если синтаза мирцена и синтаза GPP mERG20p, сконструированная нами, были со-localized в ядре, тогда как цитозольная экспрессия не позволила достичь детектируемого уровня мирцена при их коэкспрессии. Реконструкция полного пути мевалоната (MVA) в ядре еще больше увеличила титры мирцена. Путем выявления и оптимизации ограничивающих по скорости шагов мы существенно увеличили метаболический поток к мирцену, достигнув конечного титра в 23.4 мг в ферментации в шейкерах. Эта работа демонстрирует осуществимость перепрофилирования ядра дрожжей для эффективного биосинтеза мирцена и предоставляет новую стратегию для дальнейшего улучшения микробного производства мирцена.

Идентификация инфекций вируса простого герпеса (ВПГ), устойчивых к ацикловиру, имеет важное значение для выбора соответствующей противовирусной терапии, особенно для иммуносупрессированных пациентов, где уровень устойчивости может достигать 30%. В 2020 году Клиническая вирусологическая лаборатория Университета Вашингтона запустила первый клинический тест на генотипическое сопротивление ВПГ к лекарствам в Соединенных Штатах. Хотя генотипическое тестирование обеспечивает значительно более быстрые сроки выполнения, чем традиционные фенотипические тесты, его интерпретация зависит от установленных баз данных мутаций и остается сложной, когда выявляются новые варианты. Здесь мы ретроспективно рассмотрели все тесты секвенирования Sanger на устойчивость к ацикловиру ВПГ, проведенные с января 2020 года по ноябрь 2025 года в этой основной национальной референсной лаборатории. Мутации, выявленные с помощью клинического секвенирования, были сопоставлены с опубликованными базами данных мутаций UL23 ВПГ для определения их фенотипического эффекта. За почти шести лет исследования было секвенировано 136 образцов с медианой времени выполнения 10,6 дней. Среди них 65 образцов (47,8%) имели мутации устойчивости к ацикловиру, включая 45 мутаций сдвига рамки. Примечательно, что среди 100 образцов (73,5%) с мутациями, которые на момент клинического тестирования не были известны как вызывающие устойчивость к ацикловиру, мы выявили 56 различных мутаций, включая 23, которые не были охарактеризованы ранее. Наш национальный опыт демонстрирует, что генотипическое тестирование ускоряет получение практических результатов в клинической практике и подтверждает, что мутации сдвига рамки остаются основным фактором устойчивости к ацикловиру. Кроме того, благодаря выявлению этих 23 новых вариантов, данная работа предоставляет критически важные цели для будущей биохимической и фенотипической характеристики мутаций UL23 ВПГ.

ВВЕДЕНИЕ: Точная идентификация болезни Альцгеймера (БА), легкого когнитивного нарушения (ЛКН) и связанных с ними деменций на основе МРТ остается сложной задачей, поскольку структурные изменения, связанные с заболеванием, часто бывают незначительными и гетерогенными. Мы разработали NeuroBridge, клинически направленную многозадачную МРТ-рамку для диагностики нейродегенеративных заболеваний. МЕТОДЫ: NeuroBridge интегрирует крупномасштабное самообучение на основе МРТ с сегментацией гиппокампа, классификацией атрофии гиппокампа и реконструктивными задачами, после чего происходит тонкая настройка с использованием управления доступом. Эффективность была оценена на когортах ADNI и OASIS, включая перекрестную передачу когорт, анализ на основе вероятности и оппортунистический скрининг. РЕЗУЛЬТАТЫ: NeuroBridge достиг наивысших показателей по всем оцененным задачам классификации, достигнув 88,17% точности для БА против когнитивно нормальных контролей в ADNI и 82,78% в OASIS. Наибольшие приросты наблюдались в контексте, связанном с ЛКН, и смешанных диагнозах. Рамка продемонстрировала сильную обобщаемость между когортами, систематические ассоциации между вероятностью предсказанного класса и точностью, а также осуществимость оппортунистического скрининга на основе вероятности. ОБСУЖДЕНИЕ: Клинически направленное многозадачное представление улучшает диагностику нейродегенеративных заболеваний по результатам МРТ по сравнению с традиционными однозадачными подходами. NeuroBridge предлагает надежную и масштабируемую рамку для оценки деменции и оппортунистического скрининга на основе МРТ.

В данном исследовании стремились охарактеризовать экспрессию циклин-зависимой киназы 1 (CDK1) в раке мочевого пузыря (РМП), прояснить её роль в межклеточном сигналинге и митозе, а также выявить маломолекулярные ингибиторы, нацеленные на CDK1. Данные секвенирования РНК из нескольких баз данных были интегрированы, при этом иммуноистохимия на тканевых микромассивов подтвердила экспрессию белка. Выполнены одномоментное секвенирование РНК, пространственная транскриптомика, анализ обогащения генов и молекулярное докинг с молекулярно-динамическими симуляциями. mRNA и белок CDK1 были значительно переэкспрессированы в тканях РМП. Экспрессия CDK1 коррелировала с возрастом и расой пациентов. CDK1 преимущественно экспрессировалась в эпителиальных клетках и была центральной в межклеточной коммуникации, опосредованной плейотропином; виртуальный нокаут CDK1 значительно уменьшал силу сигнала. Пространственная транскриптомика подтвердила обогащение CDK1 в опухолевых участках. Анализ обогащения генов связал CDK1 с митозом и сегрегацией хромосом, а анализы одномоментного секвенирования РНК выявили регуляторную ось PTN-CDK1-митоз, активную именно в эпителиальных клетках. Динациклиб продемонстрировал благоприятную стабильность в молекулярно-динамических симуляциях как ингибитор CDK1. CDK1 значительно переэкспрессирована в РМП с хорошей дискриминационной способностью. Преимущественно экспрессируясь в эпителиальных клетках РМП, CDK1 может активироваться сигнанием для управления митозом. Молекулярно-динамические симуляции подтверждают динациклиб как многообещающий ингибитор, нацеленный на CDK1.

Мелкоклеточный рак легкого (МРЛ) — это высокоагрессивная злокачественная опухоль с ограниченными терапевтическими достижениями. В отличие от многих других видов рака, его иммунный ландшафт, особенно иммунная компетенция и распознавание T-клеток, остается недостаточно изученным. Здесь мы создали атлас транскриптома отдельных клеток иммунной микросреды МРЛ с парным секвенированием T-клеточных рецепторов (TCR). Связывая состояния T-клеток с клональностью и многослойным функциональным скринингом, мы идентифицировали 6 опухле-реактивных TCR, которые распознают и уничтожают аутологичные клеточные линии МРЛ. Мы описали новую сигнатуру CD8+ T-клеток, реактивных на МРЛ (SCLC_TR), что позволяет идентифицировать 47 дополнительных опухле-реактивных TCR. Сигнатура SCLC_TR показывает исключительные результаты в аденокарциноме поджелудочной железы (ПДК), еще одной опухоли с холодной иммунной реакцией, и, что особенно примечательно, пациенты с повышенными баллами по сигнатуре SCLC_TR демонстрируют значительно улучшенное выживание, подчеркивая ее прогностический потенциал. Сравнительный анализ взаимодействия клетка-клетка указывает на несколько иммунодепрессивных механизмов, при этом миелоидные клетки и CD4+ регуляторные T-клетки, возможно, выступают в роли противовесов для активности эффекторных T-клеток при МРЛ. В заключение, наше исследование бросает вызов устоявшемуся мнению о МРЛ как о опухоли с холодной иммунной реакцией, предоставляя прямые доказательства опухле-реактивных T-клеточных ответов и вводя сигнатуру SCLC_TR как инструмент для идентификации опухле-специфических T-клеток и их микросредовых ограничений и механизмов уклонения, в конечном итоге формируя стратегии иммунотерапии следующего поколения.

Коллаген типа III (COL3A1) является важным фибриллярным коллагеном, который широко представлен в сосудистых и кожных тканях, играя жизненно важную роль в заживлении ран и восстановлении тканей. Растущий спрос на COL3A1 в биомедицинских и косметических приложениях стал стимулом для разработки рекомбинантных систем производства. В этом исследовании мы разработали платформу для секреторной экспрессии полного по длине человеческого COL3A1. Сначала мы протестировали и сравнили две стратегии для содействия образованию тройной спирали: коэкспрессию пролил-4-гидроксилазы (P4H) и слияние с С-концевым тримеризационным доменом T4-фибритина. Структурные анализы показали, что слияние с T4-фибритином было значительно более эффективным, чем коэкспрессия P4H, в содействии образованию тройной спирали и последующей фибриллярной самоорганизации. Функционально COL3A1 с слиянием T4-фибритина обладал оптимальной биологической активностью, значительно способствуя пролиферации и миграции мезенхимальных стволовых клеток, а также ускорению коагуляции крови. Более того, система экспрессии была оптимизирована путем скрининга сигнальных пептидов и промоторов, а также настройки параметров ферментации, что повысило выход полного по длине человеческого COL3A1 до 0,22 г/л в 250 мл шейк-флаконах. Наконец, масштабирование было проведено в 5-литровом биореакторе, и состав среды был оптимизирован для предотвращения деградации белков, что дало выход 0,9 г/л. Это исследование закладывает основу для промышленного производства биологически активного, полного по длине тройного спирального человеческого COL3A1, тем самым открывая путь для его применения в качестве функционального биоматериала при восстановлении кожи и регенеративной медицине.