Новый метод обратного маскирования текстуры для выявления критических рецидивных процессов в человеческом зрении

Уточнение взаимосвязи между структурой и функцией важно для понимания работы мозга. В Drosophila melanogaster доступны данные о соединениях, полученные с помощью электронной микроскопии на основе FlyEM и FlyWire, а также данные о кальциевом изображении всего мозга. Мы применили методы предварительной обработки из функциональной магнитно-резонансной томографии (фМРТ) к данным о кальциевом изображении всего мозга и всесторонне исследовали оптимальные параметры. Затем мы обнаружили, что корреляция между функциональной и структурной связностью (FC-SC) линейно снижается с увеличением количества регионов интереса, и эта тенденция была одинаковой как у мушек, так и у людей. Мы также разработали новый, более надежный метод для количественной оценки степени пред- и постсинаптической сегрегации и исследовали это в мозге мух. Это показало, что многие нейроны имеют несегрегированные синапсы. Мы извлекли высоко несегрегированные синапсы и сравнили их с случайно извлеченными нулевыми матрицами SC. Их корреляция FC-SC была значительно выше, что указывает на то, что эти синапсы хорошо способствуют FC. Напротив, высоко сегрегированные синапсы показали значительно более низкую корреляцию FC-SC и меньше способствуют FC. Нейроны с несегрегированными синапсами, подобные неимпульсным нейронам, распределены по всему мозгу и считаются важными для FC.

Флуоресцентная микроскопия со световым листом (LSFM) произвела революцию в биологическом изображении, обеспечивая высокое пространственное и временное разрешение с минимальным фотоповреждением. Тем не менее, традиционные методы LSFM часто страдают от полосатых артефактов в получаемых изображениях из-за рассеяния и поглощения света в образцах, что приводит к неравномерному освещению и негативно сказывается на точности последующего анализа изображений. Чтобы решить эту проблему, мы представляем додекагонную флуоресцентную микроскопию со световым листом (dodecaLSFM) — новый подход, который максимизирует угловое разнообразие для достижения однородного освещения и подавления полосатых артефактов. DodecaLSFM использует дифракционную оптику и цилиндрические линзы для генерации двенадцати световых листов, обеспечивая всенаправленное освещение на 360 градусов, что значительно улучшает однородность освещения по сравнению с традиционными системами mSPIM, mDSLM и ультромикроскопии, которые используют только одну или две плоскости освещения. Мы продемонстрировали эффективность dodecaLSFM, достигнув высокоразрешающего изображения всей сосудистой системы мозга мыши после очищения ткани, что позволяет проводить точный морфометрический анализ сосудистых сетей без полосатых артефактов. Более того, мы показываем, что сочетание dodecaLSFM с расширенной микроскопией (ExM) обеспечивает 3D-изображение целого органа с клеточным разрешением. Этот новый подход предлагает усовершенствованное и масштабируемое решение для объёмной микроскопии, способствуя детальным структурным и функциональным исследованиям в разнообразных биологических приложениях.

Несмотря на важность убиквитинирования в клеточной сигнализации и судьбе белков, его обнаружение в протеомных экспериментах представляет собой множество проблем для исследователей. В частности, современные методы, часто основанные на антителах, специфичных к модификациям аминокислот на основе лизина, могут не обнаружить неканонические участки убиквитинирования в экспериментах. Мы задумали стратегию, использующую сортазу, бактериальный фермент-транспептидазу, для селективного модифицирования участков убиквитинирования с помощью биотинового тега для обогащения и дальнейших протеомных экспериментов. В данной работе мы демонстрируем нашу возможность селективно модифицировать N-концевые диглициновые остатки в переваренных белках с помощью пептида, модифицированного биотином, что позволяет далее обогащать ранее убиквитинированные белки. Мы показываем этот принцип на нескольких рекомбинантных белках, выявляя участок аутоубиквитинирования в E2-конъюгировании фермента Ubc13. Мы демонстрируем, что элюция обогащенных пептидов может быть достигнута с использованием обычных гуанидиниевых элюций или за счет обратимости сортазы. Наконец, мы включаем бифункциональный пептид, который легко разрушается при действии трипсина, чтобы лучше оптимизировать эту стратегию для последующих протеомных подходов. Мы предполагаем, что этот подход предоставит доступную стратегию для обнаружения убиквитинированных белков в протеомных экспериментах, с целью помочь исследователям лучше обнаруживать неканоническое убиквитинирование белков.

Обнаружение мутаций митохондриальной ДНК (мтДНК) на уровне отдельных клеток имеет значительный потенциал для определения клональных связей в масштабе, в сочетании с информацией о состоянии клеток у человека. Предыдущие методы фокусировались на мутациях с высокой гетероплазмией, которые, хотя и содержат ценные данные, редки и могут подвергаться функциональному отбору, что ограничивает информацию о родстве и потенциально вводит искажения в отслеживании. Хотя более сложно обнаружить, промежуточные и низкие мутации с гетероплазмией мтДНК имеют ценность из-за своего высокого разнообразия, обилию и меньшей предрасположенности к отбору. Для улучшения обнаружения мутаций мтДНК и содействия точному отслеживанию родословной мы разработали подход, называемый «Регуляторный мультиомикс с глубоким профилированием митохондриальных мутаций» (ReDeeM), представляющий собой интегрированную экспериментальную и вычислительную структуру. Здесь мы конкретно рассматриваем две аналитические проблемы, которые являются центральными для анализа родословной на основе мтДНК: достоверность рабочих процессов вызова вариантов и надежность филогенетического вывода. Мы демонстрируем, что, воспользовавшись ошибками поправки на основе консенсуса, вызовы мутаций мтДНК ReDeeM достигают высокой достоверности, соотносясь с настоящими мутационными сигнатурами даже для мутаций, поддерживаемых одной молекулой на клетку. Мы также разработали улучшенный подход к фильтрации после консенсуса, названный «filter2», который систематически идентифицирует и фильтрует остаточные артефакты, обогащенные краями, хотя они затрагивают лишь меньшинство вызовов мутаций. Чтобы систематически проверить ReDeeM, мы недавно провели эксперимент с лентивирусным баркодированием в человеческих гемопоэтических стволовых клетках, уникально пометив каждую клетку перед ее расширением и дифференциацией, чтобы предоставить основную правду для оценки точности отслеживания родословной. Такая валидация демонстрирует, что оригинальный аналитический подход ReDeeM (filter1) надежно восстанавливает истинную клональную структуру с высокой разрешающей способностью и отзывчивостью. Включение промежуточных и низких вариантов гетероплазмии (<10% на клетку) значительно улучшает выводы о родословной, в то время как исключение мутаций, поддерживаемых одной молекулой на клетку, удаляет истинный клональный сигнал и ухудшает восстановление истинных клонов. Оба фильтра filter1 и filter2 точно восстанавливают истинные клоны и превосходят ранее использовавшиеся подходы на основе мтДНК в отношении точности и отзывчивости, при этом filter2 обеспечивает дополнительные улучшения в производительности. Наконец, хотя ReDeeM продвигает отслеживание родословной на основе мтДНК, восстанавливая истинные клоны с высокой разрешающей способностью, количественная оценка филогенетической неопределенности от митохондриального наследования остается нерешенной. Для решения этой проблемы мы недавно разработали и проверили MitoDrift как платформу следующего поколения, учитывающую дрейф для отслеживания родословной мтДНК, которая дополнительно укрепляет филогенетический вывод и предоставляет интерпретируемые оценки неопределенности.

Введение. Критически большие костные дефекты не могут заживать самостоятельно, что требует дополнительных и зачастую обременительных методов лечения. Таким образом, были исследованы различные синтетические заменители кроветворных тканей. Поликапро лактат (PLLA) и полигликолевую кислоту (PGA) признали многообещающими биодеградируемыми каркасными материалами. Добавление неорганических материалов, таких как карбонат кальция (CC), также было показано как полезное. Это исследование направлено на изучение влияния каркасов PLLA-PGA-CC на регенерацию костной ткани при критически больших костных дефектах на протяжении двух лет наблюдений с использованием овец в качестве модели животного. Методы. Критически большие дефекты углов челюсти были созданы у двенадцати самок мешочниц. Дефекты челюсти были реконструированы с использованием каркасов PLLA-PGA-CC у четырех овец, в то время как оставшиеся восемь служили контрольной (без заполнения) группой. Каркасы изготавливались с использованием компьютерного проектирования и производства, с учетом взаимосвязанной пористой структуры и фиксировались с помощью клеток из полиэфирэтеракетона. Регенерация костной ткани оценивалась с использованием компьютерной томографии (КТ) через 3, 12 и 24 месяца после операции. Объем кости оценивался количественно. Кроме того, был проведен гистологический анализ. Результаты. Хирургические процедуры прошли успешно и без серьезных осложнений. Оценка КТ показала больший объем регенерации кости в группе каркасов (средний объем: 7472 мм³) по сравнению с контрольной группой (4168 мм³, p = 0.1) через 24 месяца после операции. Резорбция каркасов и формирование компактной ламеллярной костной ткани были подтверждены гистологическим анализом. Однако остеокондуктивные свойства каркасов были ограниченными, с минимальным прорастанием костной ткани в пористую структуру. В обеих группах наблюдались инвазия фиброзной ткани и образование кистозных полостей в области дефекта. Заключение. Каркасы PLLA-PGA-CC были признаны биосовместимыми и способствовали регенерации костной ткани по сравнению с контрольной группой. Из-за инвазии фиброзной ткани и недостатка остеокондуктивности пригодность материала для реконструкции критически больших костных дефектов ограничена.

Картирование на основе заданий стало многообещающей техникой в функциональной магнитно-резонансной томографии (фМРТ) для надежной характеристики и картирования уникальных паттернов активности отдельных людей. Эти эксперименты включают в себя получение обширных данных визуализации у одного участника, что в конечном итоге улучшает чувствительность и специфичность индивидуальной функциональной локализации. Несмотря на свои преимущества, исследования в основном сосредотачивались на понимании специфической активации коры, что препятствует целостному взгляду на функциональный ответ на уровне систем, и до настоящего времени лучшие подходы к статистическому анализу контролируемых заданий на основе плотно собираемых данных всего мозга еще не были полностью установлены. Поэтому в этом исследовании мы собрали данные многоканальной плотно собранной фМРТ аудиологической системы, которая имеет основные подкорковые компоненты, и оценили чувствительность активации, а также стабильность активации в подмножествах данных, используя стандартные подходы к тестированию выводов на уровне всего мозга и специфичных регионов. Подходы на уровне всего мозга включали стандартные схемы вывода на уровне вокселей и кластеров с различными статистическими порогами, а также непараметрический метод перестановочного вывода. Регионально-специфические подходы включали исследовательские методы топ % t-статистик и непараметрические методы перестановочного вывода. Мы обнаружили, что подход на уровне вокселей с коррекцией по уровню ложных открытий (FDR) (p<0.05) продемонстрировал наивысшую чувствительность среди регионов и субъектов, а также наиболее последовательное обнаружение ожидаемых слуховых регионов, даже при более низкой продолжительности сканирования. Кроме того, мы обнаружили, что подход с использованием т-статистики на уровне регионов может быть полезным исследовательским инструментом функциональной локализации и дополнительным методом к стандартным подходам к тестированию выводов.